Greitų variantų lentelė
Pigūs skrydžiai
Cheminė biologija Anotacija Daugelis biotechnologijų naudoja papildomus fragmento fluorescencinius baltymus sFPs fragmentus, kad vizualizuotų baltymų ir baltymų sąveiką, vaizdų ląsteles ansamblio arba vienos molekulės fluorescencinės mikroskopijos būdu arba surenka nanomedžiagas ir baltymų antstatus. Vis dėlto sFP surinkimo mechanizmai, įskaitant fragmentų surišimo greitį, sulankstymą, chromoforo brendimą ir bendrą fotofiziką, lieka silpnai apibūdinti.
Čia mes sukūrėme asimetrinius ir savarankiškai papildančius žalius, geltonus ir cianinius sFP kartu su jų viso ilgio ekvivalentais flFPs ir aprašėme jų biochemines ir fotofizines savybes in vitro ir ląstelėse.
Nors pakartotinai sumontuoti sFP turi spektrines savybes, panašias į flFP, jos turi šiek tiek greitų variantų lentelė kvantinį derlingumą ir fluorescencijos trukmę dėl mažiau tvirtos β-statinės struktūros.
In vitro išreikštų rekombinantinių sFP komplementacija vyksta pagal konformacinį atrankos mechanizmą, pagal kurį didesni sFP fragmentai egzistuoja monomero-dimero pusiausvyroje ir tik monomerai yra kompetentingi fluorescencijos komplementacijai. Ši bimolekulinė fragmentų sąveika apima lėtą ir negrįžtamąjį jungimosi etapą, po kurio chromoforo brandinimas vyksta panašiai kaip ir flFPs.
Išreiškiant ląstelių sintezės žymes, sFPs veikia kaip monomerai, tiesiogiai suaktyvinti sintetiniais papildomais fragmentais.
Jie suteikia ne tik skonį, bet ir terapinio poveikio pastovumą.
Šio tyrimo metu buvo sukurti sFP spalvų variantai, turintys patobulintą brandinimo kinetiką, ryškumą ir fotofiziką ląstelinių procesų fluorescencinės mikroskopijos vaizdavimui, įskaitant vienmolekulių aptikimą.
Įvadas Žalieji žalieji fluorescenciniai baltymai sGFPkuriuose simetriškas GFP β-vamzdelio 1 skilimas arba strateginis vieno ar kelių β-juostų 2, 3, 4, 5, 6 pašalinimas yra suprojektuotas kontroliuoti pilną - ilgio GFP flGFPssuteikia galingus metodus tyrinėti GFP β-krypties struktūrinį stabilumą, taip pat jo tripeptido chromoforo fotofiziką ir fotochemiją SYG67 5, 6, 7, 8, 9.
Vakarienė per 20 minučių - net 36 puikūs receptai
Tokie papildomi sGFP greitų variantų lentelė gali būti papildomai naudojami kaip baltymų žymenys, siekiant įvertinti rekombinantiniu būdu išreikštų baltymų 3 tirpumą, tirti baltymų pasiskirstymą ląstelėse ir gyvūnuose ansambliu arba vieno molekulės fluorescencijos vaizdu 10, 11, 12, 13, 14, 15, nukreipti į nanomedžiagas.
Tai apima asimetriškai suskaidytą sGFP 1—10 OPT 3 čia vadinama sGFPori ir jo papildomą 11 - ųjų grandinės peptidą čia nacionalinė kriptovaliuta M3 peptidukuris greitai susitraukia ir sudaro stabilius baltymų sintezės žymenis. Konkrečiai, mes aprašome naują sGFPori variantą, vadinamą sGFP2, kuris rodo patobulintas optines savybes pažangiosioms vaizdavimo programoms, pavyzdžiui, fluorescencijos pavienių molekulių sekimas gyvose ląstelėse komplementacijos aktyvuota šviesos mikroskopija CALM 14, Siekdami toliau gerinti fotofizines savybes, taip pat sGFPori ir pilno ilgio GFPori flGFPori sulankstymą ir brendimą, mes įvedėme keletą taškų mutacijų aplink chromoforą ir baltymų paviršių.
Spektrinės savybės, fluorescencinis gyvavimo laikas ir ryškumas. Pilno dydžio vaizdas Visų ilgių FP ir split-FP variantų fluorescencijos trukmė Visų sFP ir flFP variantų fluorescencijos trukmė τ buvo nustatyta dviejų fotonų dažnio srities gyvavimo matavimais esant nm sužadinimui. Tai greičiau dėl to, kad chromoforas yra labiau veikiamas aplinkinei aplinkai dėl mažesnės patikimos baltymų struktūros iš naujo surinktų sFPs, palyginti su flFPs, kur chromoforas yra gerai apsaugotas β-barelio.
Iš tiesų, papildomi sFP turi didesnį jautrumą guanidino hidrochlorido denatūravimui, lyginant su flFPs pusiausvyros išsiskyrimo tyrimuose papildomas Fig. YFP variantų atveju tikimasi, kad TY pakaitalas sukels reikšmingą emisiją iš chromoforo I būsenos su ilgesniais fluorescenciniais gyvavimo trukmėmis nei chromoforo B būsenos emisija Papildomas A-būklės trumpas fluorescencijos tarnavimo laikas 36, 37 flYFP2 ir flYFP3 yra suderinamas su likusia absorbcija esant nm šiuose variantuose.
Atkreipiame dėmesį, kad toks greitų variantų lentelė stabilizavimas ir jo galimas padidintas planas 38, 39 atitinka didesnį kvantinį išeigą ir didesnį YFP1 ekstinkcijos koeficientą, palyginti su YFP2 ir YFP3 1 lentelė.
Dviejų eksponentinių gyvavimo trukdžių taip pat stebimi abiejuose flCFP variantuose, suderinus su dviem fluorescencijos trukmėmis, apie kurias anksčiau buvo pranešta ECFP Trumpiausias flCFP1 ir flCFP2 veikimo laikas yra atitinkamai 0, 98 ns ir 0, 97 ns 1 lentelėgerai suderinus su antruoju ~ 0, 6 ns Greitų variantų lentelė 40 veikimo laikotarpiu, kuris yra susijęs su chromoforo B būsenos konformacija.
Vėlgi, papildomi sCFP turi trumpesnį fluorescencijos trukmę ir yra jautresni cheminiam denatūravimui nei flCFP 1c pav. Ir 1 lentelė. Toks sumažintas kvantinis derlius atitinka sumažėjusius fluorescencijos trukmės, stebėtus komplementuotiems sGFP variantams, palyginti su flGFPs, ir rodo, kad β-barelis aplink chromoforą pakartotinai surinktose sFP yra mažiau standus nei flFPs, todėl chromoforas yra santykinai mobilus 47, Skirstytų GFP variantų fotobleaching savybės Be papildomų sGFP variantų kvantinio išeigos ir ekstinkcijos koeficiento tyrinėjimo, taip pat palyginome jų ansamblių fotobleachavimo charakteristikas su papildomo sGFPori savybėmis esant pastoviam nm sužadinimui.
EGFPs fotobleachavimo kinetika paprastai apima dvi fazes: i fotokonvertuojamos tamsios fazės, kuriai būdingas greitas, tačiau grįžtamasis fluorescencijos intensyvumo sumažėjimas, ir ii negrįžtama fotobleachavimo fazė, kuriai būdingas lėtesnis ir nuolatinis fluorescencijos sumažėjimas dėl foto- chromoforo 50 sunaikinimas 2a pav.
Fotografijos priekinės ir atgalinės šviesos spartos k 1 ir k 2taip pat negrįžtamas fotoblankavimo greitis k 3 buvo nustatytos kiekvienos papildytos sGFP fotobleachavimo kinetikos sujungimu su diferencialinių lygčių rinkiniu 2b pav.
Ir papildomas.
Sąrašas:Šalys pagal populiacijos augimo greitį
Tarp papildytų sGFPs, sGFPori rodo sparčiausiai k 1 spartą į fotokonvertuojamąją būseną ir lėtiausią atgalinį tvirta galimybė iš šios tamsios būsenos k2nurodant, kad yra labiau linkę būti įstrigę ne fluorescuojančioje tamsioje būsenoje nei kiti žalieji variantai 2c pav.
Greitų variantų lentelė pakaitalas sGFP1 riboja gaudymą tamsoje būsenoje, daugiausia sumažindamas priekinį k 1 greitį į fotokonvertuojamąją būseną. Papildomas sGFP2 yra mažiau linkęs įeiti ir išlikti fotokonverguojamoje tamsioje būsenoje, palyginti su sGFPori, bet fotoblobai, kurių greitis panašus į sGFPori greitį, esant nuolatiniam sužadinimui.
Papildomų sGFP variantų fotobleachavimo kinetika. Pilno dydžio vaizdas Pilno ilgio FP variantų sulankstymo kinetika FlFP sulankstymo greitis buvo nustatomas stebint greitų variantų lentelė fluorescencinį regeneravimą po FP β-barelio denatūravimo karbamido 95 ° C temperatūroje ir praskiedimo indukuoto refoldavimo denatūratoriaus neturinčiame buferyje 51, 52 3a pav. Šis gydymas sukelia FP natūralios struktūros praradimą ir subrendusį ir chemiškai nepažeistą chromoforą supančiai aplinkai, todėl pradinis fluorescencijos išnykimas, kuris susigrąžina, kai FP atkuria tretinę struktūrą denatūratoriaus neturinčiame buferyje 53, Visų flFP variantų sulankstymo kinetika buvo vertinama pritaikant šią fluorescencijos atkūrimą trijų eksponentinių funkcijų 3b pav.
Naršymo meniu
Šie sulankstymo koeficientai taip pat gerai greitų greitų variantų lentelė lentelė su daugiafaziu atkūrimo kinetiku, apie kurį pranešė Huangas ir Bystroffas 5, nors mūsų skirtingos denatūravimo ir gavimo sąlygos neleido aptikti šių autorių minėtos labai greito flGFPori sulankstymo greičio konstanta.
Mes taip pat nustatėme daug lėtesnę greičio konstantą k mat0. Pilna ilgio FP susitraukimas ir brendimas. SE: standartinė tinkamumo paklaida.
Šie sulankstymo patobulinimai greičiausiai atsiranda dėl sulankstomų reporterių ir superfolder mutacijų, kurios buvo laikomos visose trijose flyFP, su papildomu TS pakaitalu flYFP1 ir flYFP2 dalyvavo dar labiau pagerinti sulankstymo kinetiką, palyginti su flYFP3.
Chromoforo brandinimo kinetika ištisų FP variantų Be flFP sulankstymo greičio, taip pat nustatėme greitų variantų lentelė varianto chromoforų brendimo greitį, naudojant ditionitą redukuojančiu agentu denatūravimo metu, ir matuojant chromoforo 25, 53 ribotą oksidacijos stadiją, kai praskiedimo indukcinis rišimasis prasiskverbimas į denatūrą ir be jo. Kiekvienam flFPs sumažinto chromoforo fluorescencijos regeneravimas buvo sumontuotas viena eksponentine funkcija, kad būtų išgautas negrįžtamas ir pirmojo laipsnio brandinimo greičio konstanta k kilimėlis 3b pav.
Kaip parodyta Fig. Padalintų FP savireguliavimo procesas Po to, kai buvo apibūdinti sulankstymo ir brendimo procesai flFPs, mes ištyrėme sFP surinkimo kinetiką su komplementariu ų lapų M3 peptidu, pagamintu sintetiniu būdu ir papildomai nustatant jų komplementacijos sukeltus chromoforo brendimo laipsnius.
Kaip pradinį modelį, mes pirmą greitų variantų lentelė svarstėme, kad rekombinantiniu būdu pagamintas sGFPori ir visi greitų variantų lentelė variantai yra didžiausiomis koncentracijomis dažniausiai dimeriniai, kaip pranešta anksčiau 3, bet kad sFP monomerai tampa dominuojančia frakcija esant mažai baltymų koncentracijai 4a pav.
Ši sFPs koncentracijos priklausoma dimero-monomero pusiausvyra dar buvo apibūdinta pastovios būsenos fluorescencijos anizotropijos matavimais, naudojant ReAsH, fluorescencinį dažiklį, kuris standžiai žymi tetracysteino žymeklį 57, užkoduotą kiekvieno SFP N-gale. Matomas dimero susidarymo pusiausvyros konstantas K eq buvo nustatytas pritaikant šią anizotropijos kreivę su modeliu, skirtu dimero-monomero disociacijai 58 4c pav.
Koncentracijos priklausomi dimerų-monomerų mainai rekombinantiniuose skilimo fluorescenciniuose baltymuose. K eq yra dimero susidarymo pusiausvyros konstanta. Kalibruotų molekulinės masės standartų rinkinio 68, 43, 29 ir 14 KDa sulaikymo trukmės pateikiamos kaip atskaitos taškai.
V srautas. Raskite valties tempimo greitį.
Greitų variantų lentelė dimero susidarymo pusiausvyros konstanta K ekv. Nustatoma prijungiant anizotropijos kreivę su įdėklo lygtimi žaliakuri apibūdina ansamblio anizotropiją, kurią skatina tiek dimero anizotropija rdtiek monomero anizotropija rm kiekvienoje bendroje sGFP2 koncentracijoje.
Anizotropijos vertės pateikiamos kaip vidurkis ± std iš trijų egzempliorių. Pilno dydžio vaizdas Be to, mes apsvarstėme paprastą sFP komplementacijos modelį, kuris apima pirmąjį negrįžtamą papildomų M3 peptidų prisijungimo etapą tik monomeriniams sFP, po to seka antrasis negrįžtamas chromoforo brendimo etapas 5a pav.
Iš tiesų, kaip anksčiau pranešta apie sGFPori 3, 14 ir kitas FP pagrindu veikiančias bimolekulines fluorescencines komplementavimo sistemas 59, komplementarių fragmentų ir FP pakartotinio surinkimo susiejimas yra negrįžtamas ir papildomas fluorescencinis sGFPori investavimo platforma yra monomeras.
Siekiant įvertinti šio modelio pagrįstumą, tyrinėjome sFP surinkimo fluorescencinę kinetiką su M3 peptidu pseudo-pirmosios eilės sąlygomis, kai didėjančios sFP koncentracijos titruojamos maža, bet pastovi M3 peptido koncentracija 5b pav.
Kaip parodyta sGFP2, k obs pasiskirstymas yra tiesiškai priklausomas nuo sGFP2 monomerų koncentracijos, nustatytos naudojant sGFP2 dimero susidarymo pusiausvyros konstantą, tačiau parodė nelinijinę priklausomybę nuo sGFP2 dimerio koncentracijų ir bendros sGFP2 koncentracijos dimero ir monomerųatitinka papildomus M3 greitų variantų lentelė tik su monomeriniu sGFP2 5c pav.
Tačiau k obs2 visose sGFP2 koncentracijose išlieka pastovi, kaip tikėtasi nepriklausomam chromoforo brandinimo etapui, kuris seka greitų variantų lentelė monomero-M3 peptidų kompleksų surinkimą 5c pav.
Informatyvios ŽŪM pjaustymo lentelės ir parlamentinei veiklai skirti pinigai -- R.I.T.A. -- S01E19
Tai rodo, kad sFP ir flFP brandinimo dažnis yra labai panašus. Brandinimo greičio konstantos, išmatuotos iš šių sFP variantų fluorescencinės komplementacijos kinetikos, dar kartą sutampa su tomis, kurios nepriklausomai nustatytos atitinkamiems flFP variantams 5d pav.
Atkreipiame dėmesį, kad išmatuotos k s reikšmės sFPs yra nuo 3 iki 5 laipsnių mažesnės, nei tikėtinos difuzijos ribotoms reakcijoms Tai rodo, kad k on žymi lėtą ir greitį ribojančią sterinę tinka- vimo procesą tarp papildomų sFP ir M3 fragmentų, kurie vyksta po difuzijos ir sąveikos, tačiau abu fragmentai yra reikalingi sąveikai. Šie kinetiniai tyrimai taip pat rodo, kad šioje asimetrinėje sFP fragmentų sistemoje komplementacija seka konformacinį atrankos procesą, pagal kurį didesni greitų variantų lentelė fragmentai egzistuoja dimero-monomero pusiausvyroje, o tik monomerai yra kompetentingi lėtai, bet negrįžtamam prisijungimui prie mažo M3.
Greiti saldumynai be orkaitės - 34 gardūs receptai!
Split-fluorescuojančių baltymų fragmentų surinkimo kinetika. Skaidrumo labui rodomas tik vienas iš trijų atliktų kopijų. Esant tokioms sąlygoms, dimero-monomero pusiausvyra oranžinės spalvos brūkšneliai a neturi įtakos rišimosi ir brendimo reakcijoms žalioji brūkšneliai a punkteleidžianti nustatyti pastebimą rišimosi greitį k obs1 ir brandinimo greitį k obs2. Pilno dydžio vaizdas Gyvų ląstelių ekspresija, fluorescencijos vaizdavimas ir split-FP sulietų baltymų variantų oligomerizacija Tada pasirinkome kai kuriuos sFP variantus, kad išbandytume jų ekspresiją kaip plazmos membraninio sulieto baltymo žinduolių ląstelėse ir palygintume jų fluorescencinę komplementaciją su sGFPori, naudojant eksogenines sintetines M3 peptidų ir CALM vaizdavimo 14 gyvose ląstelėse.
Greičiau chromoforo brandinimą, pusę karto nei sGFPori, buvo sulieti su plazmos membraninio baltymo CD14 glikozilfosfatidilo inozitolio Greitų variantų lentelė dominuojančiu domenu ir laikinai ekspresuojami U2OS greitų variantų lentelė 6a pav.
Kaip patvirtinta skerspjūvio konfokaliniu vaizdavimu, fluorescencinis aktyvavimas vyksta transfekuotų ląstelių plazmos membranoje papildomas pav. Spartus atskirų aktyvintų sFP difuzijų, stebimų bendrojo vidinio atspindžio fluorescencijos TIRF mikroskopu, sklaida papildomai rodo, kad GPI-fuzijos yra tinkamai nukreiptos į ląstelės paviršių papildomas video V1. Iš tiesų, transfekuotų ląstelių anti-CFP imunodažiavimas atskleidė, kad sCFP suliejimai nėra perkeliami į plazmos membraną, bet lieka endoplazminiame tinkle papildomas Fig.
S3o tai rodo, kad sCFP suliejimai yra netinkamai eksponuojami žinduolių ląstelėse 37 ° C temperatūroje. Šis stebėjimas atitinka sumažintą flCFP in vitro pakartotinio išpilstymo efektyvumą, palyginti su kitais spalvų variantais 3c pav.
Svarstyklės: 10 μm. Pilno dydžio vaizdas Efektyvus įvairių GPI-sGFPs ir GPI-sYFPs fluorescencinis komplementavimas gyvose ląstelėse rodo, kad ląstelių paviršiuje yra didelė monomerinių sulietų baltymų dalis, nes, kaip nustatyta biochemiškai, tik sFP monomerai yra kompetentingi fluorescenciniam aktyvavimui, kai jungiasi papildomas M3. Siekiant įvertinti galimą papildomą dimerinių GPI-sFP sulietų buvimą ląstelių plazmos membranoje, mes naudojome membraną nepralaidžią ir amino reaktyvią bifunkcinę kryžminę jungiklį bis sulfosukcinimidil subertuotą BS3kurio mažas 1, 2 nm dydis 61 leidžia kryžminį baltymų, kurie yra labai arti greitų variantų lentelė membranos, susiejimas, įskaitant dimerius Ir papildoma informacija.
Tai prieštarauja dimero-monomero pusiausvyrai, pastebėtai rekombinantiniu būdu išgrynintoms ir išgrynintoms sFP. Tai rodo, kad sFP sintezės baltymų komplementacijos efektyvumas ir fluorescencinis aktyvinimas ląstelėse priklauso tik nuo M3 peptidų koncentracijos ir kiekvieno sFP jungimosi greitų variantų lentelė on ir brendimo k mat greičių konstantų, su sąlyga, kad jie patenka į teisingą ląstelių kiekį. Individualus GPI-sGFP2, atsirandantis plazmos membranoje, lokalizuotas difrakcijos riboto taškinio plitimo funkcijos dviejų dimensijų Gausso priderinimu ir jų difuzijos trajektorijos buvo rekonstruotos susiejant lokalizuotą kiekvienos molekulės padėtį nuo rėmo iki rėmo 7a pav.
Skalės juosta: 10 μm. Labiau tikėtinas patobulinto vieno molekulinio sekimo ilgio su sGFP2 paaiškinimas yra tai, kad jis yra mažiau linkęs įstrigti fotokonverguojamoje tamsioje būsenoje, lyginant su sGFPori, kuris sumažina mirksėjimo ir laikino greitų variantų lentelė signalo praradimo tikimybę, tokiu būdu skatindamas nuoseklią rėmo sekimą.
Kartu su bendru greitesniu brendimo greičiu nei sGFPori, padidėjęs sGFP2 ryškumas ir sumažėjęs tamsiosios būsenos gaudymas suteikia patobulinimus, palyginti su sGFPori, kai jis naudojamas kaip baltymų sintezės žyma naujos dvejetainės parinktys molekulei sekti, naudojant CALM vaizdą gyvose ląstelėse. Palyginus flFP ir jų papildytas skaidymo formas, matyti, kad jie turi identiškas spektrines savybes, tačiau rekonstruoti sFP šiek tiek sumažino kvantinę išeigą ir fluorescencijos trukmę dėl mažiau tvirtos β-statinės struktūros.
Šie pakeitimai taip pat žymiai sumažina papildomo sGFPori polinkį būti įstrigę ne fluorescuojančioje grįžtamai tamsioje būsenoje ir paskatinti greitesnį flGFP sulenkimą ir greitesnį chromoforo brendimą tiek flGFP, tiek iš naujo surinktų sGFPs.
Žinomi žmonės pasidalijo skanių ir greitų patiekalų receptais, kurie nekenkia figūrai
Be to, parodėme, kad didelis fragmentinis-FP fragmentas egzistuoja nuo koncentracijos priklausomame monomero-dimero pusiausvyros, kai jis išreiškiamas kaip nefuzinis baltymas in vitro, ir kad tik Monomerinės padalintos FP yra kompetentingos fluorescencinei komplementacijai, prijungiant M3 peptidus.
Palyginti su ribotomis difuzijos reakcijomis, šis surišimo etapas yra lėtas, tačiau negrįžtamas ir po jo chromoforo brendimas vyksta panašiai kaip ir flFP. Atkreipiame dėmesį, kad kai sFP yra naudojami kaip nefuziniai rekombinantiniai baltymai, ekspresuoti ląstelėse su baltykais, kurie yra sulieti su M3 komplementariais peptidais 13, 63, atrodo, kad ši dimero-monomero pusiausvyra neturi įtakos fluorescencijos aptikimui, nors ji gali turėti įtakos komplementacijos efektyvumui ir jos kinetika, jei ekspresijos santykis tarp M3-baltymų fuzijų ir rekombinantinių sFP nėra gerai kontroliuojamas.
Priešingai, kai didelis sFP fragmentas naudojamas kaip baltymų sintezė ląstelėse, jis elgiasi kaip monomeras, kurį galima valdyti sintetiniais M3 fragmentais ansambliui arba vienmolekulių fluorescencinei mikroskopijai, kaip parodyta įvairiose GPI-sFP vladis brokeriai. Palyginus atskirų GPI-sGFPori ir GPI-sGFP2 sulietų baltymų fotofizines savybes gyvose ląstelėse, nustatyta, kad sGFP2 yra ryškesnis ir leidžia ilgesnes vienos molekulės sekimo ir trajektorijos rekonstrukcijas, nei sGFPori, atitinkantis jo didesnį kvantinį derlingumą ir mažesnį polinkį būti įstrigusiam šviesos sukeltame fotokonverguojamame tamsioje būsenoje, palyginti su sGFPori.
Kartu su padidėjusiu brendimo greičiu sGFP2 užtikrina gerą pusiausvyrą tarp M3 peptidų surišimo spartos, ryškumo ir fotostabilumo fluorescencijos vaizdavimo programoms ir kontroliuojamam nanomedžiagų ir baltymų pagrindų struktūrų surinkimui, naudojant papildomus sFP fragmentus kaip pastolius. Visos aprašytų variantų mutacijos buvo patikrintos DNR seka. DH5a kompetentingos ląstelės buvo panaudotos visiems plazmidėms išplėsti.
Vienos nakties pradinė kultūra, pagaminta naudojant vieną transformuotą E. greitų variantų lentelė
Tada ląstelės surenkamos g 30 minučių 4 ° C temperatūroje, o ląstelių nuosėdos plaunamos ledu šaltu PBS g 30 min. Mėginiai buvo centrifuguoti g 15 min. Ni-dervos karoliukai buvo naudojami kiekvienai FP valymui. Kaip plovimo buferis ir eliuavimo buferis buvo naudojami TN buferis su 10 mM imidazolu ir mM imidazolu. Fotobleachavimo kinetikai TNG buferio komplementuoti sGFP variantai buvo nuolat sužadinti esant ± 1 nm, o fluorescencijos emisija buvo surinkta ± 1 nm 40 minučių esant RT.
Fotobleachavimo kinetiniai duomenys buvo analizuojami naudojant Matlab mažiausius kvadratus, pritaikiusius fluorescencinio skilimo kreives, su tirpalu diferencialinių lygčių rinkiniui, greitų variantų lentelė fotoreveruojamus ir negrįžtamus GFP fotobleachavimo procesus papildoma informacija.
Kiekvieno baltymo ε ir Φ reikšmės buvo naudojamos ryškumui apskaičiuoti ε × Φ. Fluorescenciniai gyvenimo trukmės matavimai Fluorescencinio gyvenimo trukmės matavimai buvo atlikti dviejų fotonų dažnių srityje Zeiss LSM apverstoje mikroskopu, kuriame įrengtas 40X vandens panardinimo tikslas NA 1.
Gyvenimo trukmės vertės buvo nustatytos mažiausiai kvadratiniu būdu sujungiant fluorescencijos skilimo kreives su vienu ar dviem komponentais eksponentiniais pritaikymais naudojant ISS Bandomasis važiavimas, kaip užsidirbti pinigų programinę įrangą 4.
Tada trys egzemplioriais paruošti denatūruoti mėginiai buvo atskiesti kartų TNG ant 96 šulinėlių mikroplokštelės, kad sukeltų iš naujo. Mikroplokštelių šuliniai, kuriuose yra TNG buferis ir 50 μM nedenatūruotų flFP variantų, buvo naudojami buferiniam fonui, fotoblankavimo pataisoms ir pakartotinio išpilstymo efektyvumo vertinimams. Pilni ilgio FP mėginiai buvo paruošti be greitų variantų lentelė, ditionito arba verdančio fotobleachavimo pataisų.
Mėginiai be M3 peptidų buvo naudojami buferio fono korekcijai, o ilgalaikio fotovalymo korekcijoms buvo naudojamas 0, 1 μM atitinkamo flFP tirpalas. Naudojant Biotek SynergyH4 mikroplokštelių skaitytuvą su vertikaliais ir horizontaliais poliarizacijos filtrais, DF25 sužadinimo filtru ir DF40 emisijos filtru, buvo naudojamas matuoti skirtingų praskiedimų 20, 10, 5, 2, 5, 1, 25 ir 0, 5 anomotropijos ReAsH-sFP vertes.
Dimeerio susidarymo pusiausvyrinės konstantos K eq buvo nustatytos mažiausiai kvadratais, atitinkančiomis anizotropiją kaip sFP koncentracijos funkciją su Fig. Visi konstruktai buvo patikrinti DNR seka.
Konfokaliniai fluorescenciniai vaizdai buvo gauti Nikon C2 invertuotame konfokaliniame mikroskope su nm sužadinimo lazeriu ir DF50 nm emisijos filtru papildomiems GPI-sGFP variantams vaizduoti ir su nm sužadinimo lazeriu ir DF27 nm emisijos filtru vaizdui papildyti.
